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什么是蛋白酶K,蛋白酶K的生產有哪些挑戰?

 更新時間:2023-02-09 點擊量:868

  蛋白酶 K(Proteinase K)是一種廣譜絲氨酸蛋白酶,蛋白酶 K于1974年在fungus Engyodontium album的提取物中發現。能合成該種蛋白酶的微生物能在以角蛋白(Keratin)作為碳源和氮源的環境中生長,說明該酶可以消化角蛋白,因此被稱為“蛋白酶 K"。蛋白酶K由一條肽鏈組成,含有277個氨基酸,該蛋白的相對分子量~28.9kDa,蛋白酶K是一種穩定且具有高活性的絲氨酸蛋白酶。晶體和分子結構研究證據表明該酶屬于枯草素家族,具有活性位點催化三聯體(Asp39-His69-Ser224)。蛋白酶K家族包含了各種由革蘭氏陰性細菌、酵母及真菌分泌的細胞內肽酶。
    蛋白酶K具有非常穩定的蛋白結構、超高的蛋白水解活性以及廣泛的底物特異性,偏好于帶有脂肪族及芳香烴的肽鏈,能優先分解與含硫氨基酸、疏水性氨基酸、芳香族氨基酸的羧基端連接的肽鍵。與其它的蛋白酶相比較,蛋白酶在一系列廣泛的環境中均穩定:pH,緩沖鹽,去污劑(SDS)以及溫度。如:該酶的活力不會被尿素、SDS和EDTA等變性劑抑制,在高溫、高鹽或較高的pH等條件下,蛋白酶K仍能保持非常高活力。因該酶可以在較廣的pH范圍(4~12.5)內及高溫(50~70℃)均有活性,在0.1-0.5% SDS存在的情況下,蛋白酶K可保持活性,在不損害分離DNA完整性的前提下,可以消化DNA制劑中的多種蛋白質和核酸酶。
蛋白酶K /國家標準:
《蛋白酶K》(GB/T 34793-2017)是2018年5月1日實施的一項中華人民共和國國家標準,歸口于中國標準化研究院。《蛋白酶K》(GB/T 34793-2017)規定了蛋白酶K產品的術語和定義、技術要求、試驗方法、檢驗規則、標志、包裝、運輸及貯存。《蛋白酶K》(GB/T 34793-2017)適用于生化試劑蛋白酶K產品的生產和檢測。
蛋白酶K生產過程中的挑戰:
①表達量低:由于蛋白酶K能夠非特異性的降解大多數蛋白,因此在使用微生物表達生產該蛋白時,其表達的蛋白酶K可以對表達宿主中的有功能的蛋白進行水解,造成表達宿主不能持續的表達該蛋白,因此蛋白酶K的表達量很低。而篩選高表達量蛋白酶K的表達系統或菌株,需要花費大量的精力和較長的時間。
②不穩定性:雖然蛋白酶K可以在高溫、高鹽或較高的pH等苛刻的條件下保持很高的活性,但是該酶可以自己酶解自己,在無保護劑時,在37℃條件下很難長期穩定保存
該酶易沉淀:在制備蛋白酶K的凍干粉時,為了保證凍干粉中蛋白酶K的固含量維持在一個比較大的水平,通常需要在高濃度時加入凍干保護劑,然而在蛋白酶K濃度達到20mg/mL或者以上時,該酶很容易聚集形成沉淀,這給蛋白酶K的高固含量凍干造成了極大的挑戰。
④生產投入大:在大規模發酵時,會產生大量色素和宿主核酸的殘留,簡單的純化工藝很難除去這些雜質,而使用復雜的純化工藝則會降低了回收率并且使生產成本加大。蛋白酶K具有很強的蛋白水解活性,能夠將實驗室或車間使用到的其它酶或蛋白水解,所以生產蛋白酶K需要專門的產地、儀器設備及配套設施。
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