PCR產(chǎn)物的克隆-DNA回收實驗步驟

【實驗原理】

1.DNA片段回收方法：DNA片段在適當濃度的瓊脂糖凝膠中，通上一定電壓進行電泳，不同大小的DNA分子由于遷移率的不同而分離開。切下帶有所需DNA片段的凝膠，用凍融法、玻璃奶回收法或商品化膠回收試劑盒將目的片段回收純化。

2.利用Taq酶能夠在PCR產(chǎn)物的3’末端加上一個非模板依賴的A，而T載體是一種帶有3’T突出端的載體，在連接酶作用下，可以把PCR產(chǎn)物插入到質(zhì)粒載體的多克隆位點，可用于PCR產(chǎn)物的克隆和測序。

　　商品化的T載體有很多。本實驗采用TaKaRa公司的pMDTM18-T Simple Vector。這個載體以pUC19載體為基礎(chǔ)，消除了pUC18載體上的多克隆酶切位點，經(jīng)EcoRⅤ酶切后在兩側(cè)的3'端添上“T"制備而成（見附錄1）。由于本載體上消除了多克隆酶切位點，克隆后的PCR產(chǎn)物將無法使用載體上的限制酶切下，需要在PCR擴增引物上導入合適的酶切位點。

【試劑與器材】

（一）試劑

1.pMDTM18-T Simple Vector Kit（Takara公司）。

2.TAE電泳緩沖液

3.瓊脂糖（Agarose）

4.6×電泳加樣緩沖液：0.25％溴粉藍，40％(w/v) 蔗糖水溶液，貯存于4℃。2 / 9

5.溴化乙錠(EB)溶液母液：配制成10mg/mL，用鋁箔或黑紙包裹容器，儲于室溫即可。

6.70%乙醇

7.膠回收試劑盒（Omega公司）

（二）器材

　　水平式電泳裝置,電泳儀,臺式高速離心機, 恒溫水浴鍋, 微量移液槍, 微波爐或電爐,紫外透射儀, 凝膠成像系統(tǒng)或其它照相設(shè)備。

【操作方法】

　　（一）膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物（以O(shè)mega公司Gel Extraction Kit為例）

1.當目的片段DNA分離時，轉(zhuǎn)移凝膠至紫外燈上盡可能快地切下目的片段。

2.凝膠塊轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管(離心管已經(jīng)稱重了)中，稱重得出凝膠塊的重量。近似地確定其體積（假設(shè)其密度為1g/ml）。加入等體積的Binding Buffer（XP2），于55-65℃水浴中溫浴7min或至凝膠融化，每2-3 min振蕩混合物。（在凝膠溶解之后，注意凝膠-Binding buffer混和物的pH值。如果其pH值大于8的話，DNA的產(chǎn)量將大大減少。如果是橙色或紅色，則要加入5μl 濃度為5 M，pH為5.2的醋酸鈉，以調(diào)低其pH值。該混合物的顏色將恢復為正常的淺黃色

3.取一個干凈的HiBind DNA Mini柱子裝在一個干凈的2ml收集管內(nèi)（已備好）。

4.將第三步獲得的DNA/熔膠液全部轉(zhuǎn)移至柱子中。室溫下10,000 x g離心1分鐘。棄收集管中的濾液，將柱子套回2ml收集管內(nèi)收集管。

5.如果DNA/凝膠熔液的體積超過700ul，一次只能轉(zhuǎn)移700ul至柱子中，余下的可繼續(xù)重3 / 9

　　復第5步至所有的溶液都經(jīng)過柱子。每一個Hibind DNA回收純化柱都有一個極限為25μg DNA的吸附能力。如果預期產(chǎn)量較大，則把樣品分別加到合適數(shù)目的柱子中。

6.棄收集管中的濾液，將柱子套回2ml收集管內(nèi)收集管。轉(zhuǎn)移300μl Binding Buffer（XP2）至柱子中，室溫下，10,000 x g下離心1min。

7.棄收集管中的濾液，將柱子套回2ml收集管內(nèi)收集管。轉(zhuǎn)移700μl SPW Wash buffer（已用無水乙醇稀釋的）至柱子中。室溫下10,000xg離心1min。（濃縮的SPW Wash Buffer在使用之前必須按標簽的提示用乙醇稀釋。如果DNA洗滌緩沖液在使用之前是置于冰箱中的，須將其拿出置于室溫下）。

8.重復用700μl SPW Wash buffer洗滌柱子。室溫下10,000xg離心1min。

9.棄收集管中的濾液，將柱子套回2ml收集管內(nèi)收集管。室溫下,13,000 x g離心2 min以甩干柱子基質(zhì)殘余的液體。

10.把柱子裝在一個干凈的1.5ml離心管上，加入15~30μl（具體取決于預期的終產(chǎn)物濃度）的Elution Buffer(或TE緩沖液)到柱基質(zhì)上，室溫放置1min, 13,000xg離心1min以洗脫DNA。第一次洗脫可以洗出70-80%的結(jié)合DNA。如果再洗脫一次的話，可以把殘余的DNA洗脫出來，不過那樣的濃度就會較低。

　　（二）連接反應(yīng)（以Takara公司pMDTM18-T Simple Vector Kit為例）

1）在微量離心管中配制下列DNA溶液，全量為5 μl。

pMDTM18-T Simple Vector1 μlInsert DNA0.1 pmol～0.3 pmoldH2Oup to 5 μl4 / 9

2）加入5 μl（等量）的Solution I。

3）16℃反應(yīng)30分鐘。（2 kbp以上長片段PCR產(chǎn)物進行DNA克隆時，連接反應(yīng)時間請延長至數(shù)小時）。

4）全量（10 μl）加入至100 μl 感受態(tài)細胞中，冰中放置30分鐘。

5）42℃加熱45秒鐘后，再在冰中放置1分鐘。

6）加入890 μl LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)60分鐘。

7）在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，形成單菌落。計數(shù)白色、藍色菌落。

8）挑選白色菌落，鑒定載體中插入片段的長度大小。

【注意事項與提示】

1.使用新鮮的電泳緩沖液TAE Buffer。不要重復使用，其PH的升高會減少產(chǎn)量。

2.不論采取何種方法回收DNA，在回收過程中，要盡量減少洗脫體積，以便提高收得率和濃度，以方便后續(xù)操作。

3.從膠上回收DNA時，應(yīng)盡量縮短光照時間并采用長波長紫外燈(300-360nm)，以減少紫外光對DNA的切割。DNA曝露在紫外燈下不能超過30秒。

4.連接反應(yīng)時間是與溫度密切相關(guān)，因為反應(yīng)速度隨溫度的提高而加快。通常可采用16℃連接4小時為宜，如是平端連接需要適當延長反應(yīng)時間以提高連接效率；在選擇反應(yīng)的溫度與時間關(guān)系時，也要考慮在反應(yīng)系統(tǒng)中其他因素的影響。

5.連接反應(yīng)的整個過程應(yīng)注意槍頭的潔凈以避免造成對酶的污染，為防止酶活性降低，取酶時應(yīng)在冰上操作且動作迅速。

6.連接反應(yīng)應(yīng)在25℃以下進行，溫度升高較難形成環(huán)狀DNA，影響連接效率。長片段PCR產(chǎn)物（2kb以上）進行連接時，連接反應(yīng)時間應(yīng)延長至數(shù)小時。

7.進行克隆時，Vector DNA和Insert DNA的摩爾數(shù)比一般為1:2~10。根據(jù)實驗情況選擇合適的摩爾數(shù)比。

8.用高效的感受態(tài)細胞（轉(zhuǎn)化效率≥1×108 cfu/μg pUC19），這樣才可能得到比較理想的陽性克隆。

9.試劑盒配有Control DNA。通過對照實驗判斷試劑盒的保存效果。

【實驗安排】

　　第一天下午：配制6×電泳加樣緩沖液、TAE等緩沖液，將各種耗材滅菌。

　　第二天上午：制備瓊脂糖凝（1%），電泳檢測，切膠回收DNA片段

　　第二天下午：大腸桿菌制備感受態(tài)細胞；DNA與T載體連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌。

第三天上午：觀察轉(zhuǎn)化結(jié)果（藍白斑情況），計算重組率。