淋巴細(xì)胞微核測定是細(xì)胞遺傳學(xué)分析中常用的方法之一,通過微核率的高低可以有效判斷染色體畸變率與輻射損傷。
一、淋巴細(xì)胞分離 分離使用Ficoll-Paque密度梯度分離淋巴細(xì)胞。將血液用磷酸鹽緩沖鹽水按 1:1 稀釋，并在 Ficoll-Paque 上分層，血液 + PBS: Ficoll 的比例保持為 4:3。血液在室溫下以 1800 rpm 離心 35 分鐘。去除淋巴細(xì)胞層（血沉棕黃層）并在 PBS 中以 1200 rpm 洗滌兩次，每次 10 分鐘，然后用培養(yǎng)基 RPMI 1640 洗滌。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)細(xì)胞密度。
二、培養(yǎng)條件淋巴細(xì)胞在 15 ml 錐形聚苯乙烯離心管中的 5% CO2 加濕培養(yǎng)箱中于 37o 培養(yǎng)。通常，每個(gè)培養(yǎng)物由 2 毫升培養(yǎng)基中的 1x10 6 個(gè)細(xì)胞的初始密度組成。培養(yǎng)基由補(bǔ)充有 10% 胎牛血清 2mM L-谷氨酰胺、100 單位/ml 青霉素、100 ug/ml 鏈霉素和 1.5% 植物血凝素的 RPMI 1640 組成。
在起始后 44 小時(shí)將微核測定細(xì)胞松弛素 B 加入到培養(yǎng)物中。細(xì)胞松弛素 B 阻止細(xì)胞完成胞質(zhì)分裂，導(dǎo)致多核細(xì)胞的形成。細(xì)胞培養(yǎng)物中細(xì)胞松弛素 B 的最終濃度為 3 mg/ml。
在培養(yǎng)開始后 72 小時(shí)，使用細(xì)胞離心機(jī) (Shandon, Sewickley, PA) 將淋巴細(xì)胞直接離心到載玻片上。然后將細(xì)胞以 600 rpm 的速度旋轉(zhuǎn)到載玻片上 10 分鐘。在室溫下甲醇固定 15 分鐘之前，讓載玻片風(fēng)干。載玻片在-20℃ 下儲(chǔ)存在密封盒中，在 N2 下干燥。
三、細(xì)胞染色與微核測定染色：將甲醇固定的載玻片在含有 0.1% Tween 20 的 PBS 中孵育 5 分鐘。從載玻片中排出多余的液體，并用含有 0.2% Tween 20 的 PBS 1:1 稀釋 40-50 ul 抗動(dòng)粒抗體應(yīng)用% Tween 20。然后將載玻片蓋上蓋玻片并置于 37oC 的加濕室中 1 小時(shí)。在含有 0.1% Tween 20 的 PBS 中洗滌兩次，每次 5 分鐘后，再次排出多余的液體，用 1:50 稀釋的熒光山羊抗人 IgG覆蓋載玻片并再次孵育 1 H。因?yàn)闊晒鈽?biāo)記的抗體暴露在光線下會(huì)褪色，此步驟和所有后續(xù)步驟應(yīng)在黃燈下進(jìn)行。將載玻片在加 0.1% Tween 20 的緩沖液中沖洗兩次，并在抗褪色溶液中用 4'6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) (2 ug/ml) 復(fù)染。
對(duì)于
淋巴細(xì)胞微核測試，對(duì) 1000 個(gè)雙核淋巴細(xì)胞（那些經(jīng)歷了一次有絲分裂分裂的細(xì)胞）進(jìn)行檢測，每個(gè)重復(fù)培養(yǎng)物中的 500 個(gè)細(xì)胞，用于計(jì)算微核的數(shù)量。通過切換到熒光濾光片來確定動(dòng)粒點(diǎn)的存在與否。
檢測標(biāo)準(zhǔn)如下：
1) 細(xì)胞應(yīng)具有完整的細(xì)胞質(zhì)的圓形或橢圓形外觀
2) 細(xì)胞核應(yīng)同樣為圓形或橢圓形，具有完整的核膜
3) 只有經(jīng)歷過一次核分裂的細(xì)胞才應(yīng)檢測微核的存在
4) 僅當(dāng)微核大小為主核的三分之一或以下時(shí)才應(yīng)計(jì)數(shù)
5) 微核的染色應(yīng)與主核相似
6) 微核應(yīng)與主核明顯分開。
復(fù)制指數(shù) (RI)，細(xì)胞分裂動(dòng)力學(xué)的量度，通過計(jì)算每個(gè)樣本 400 個(gè)總細(xì)胞中含有 1、2、3 或更多細(xì)胞核的細(xì)胞百分比，從對(duì)微核進(jìn)行檢測的相同載玻片上進(jìn)行檢測。
復(fù)制指數(shù)RI 計(jì)算如下：
RI = (1x% 單核細(xì)胞) + (2x% 雙核細(xì)胞) + (3x% tri) + (4x% 四核細(xì)胞）……
