SDS-PAGE的工作原理是什么？

聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N'-亞-CH3雙丙烯酰胺在催化劑過硫酸銨(AP)和N,N,N',N'-四-CH3乙二胺(TEMED)的作用下組成。它是一種具有三維網(wǎng)絡結構的凝膠。PAGE可以根據(jù)蛋白質分子的電荷和分子量不同而引起的遷移率不同，將蛋白質分成若干條帶。SDS是一種陰離子表面活性劑，它可以在還原劑DTT存在下破壞蛋白質的氫鍵和疏水鍵，并與蛋白質分子按一定比例結合形成短棒狀復合物。相同的密度，與蛋白質的分子量呈正相關，不同分子量的蛋白質所形成的復合物的長度是不同的。SDS使帶負電荷的蛋白質的數(shù)量遠遠超過其原始電荷，掩蓋了各種蛋白質分子之間的天然電荷差異。因此，各種蛋白質-SDS復合物在電泳過程中的遷移率不再受原有電荷和分子形狀的影響，而只取決于相對分子質量。

聚丙烯酰胺凝膠

聚丙烯酰胺凝膠通常由上層的濃縮膠和下層的分離膠組成。上下凝膠的區(qū)別在于丙烯酰胺的濃度和 Tris-HCl 的 pH 值。在電泳過程中，向凝膠施加電場，帶負電的蛋白質從負極遷移到正極。最常見的電泳緩沖液由 Tris 和甘氨酸組成。濃縮膠中的 pH 值為 6.8，只有少數(shù)甘氨酸分子解離。因此，經(jīng) SDS 處理的蛋白質分子在上層甘氨酸分子和下層 Cl- 離子之間移動。這個過程將凝膠中的蛋白質樣品壓縮成比最初加載的體積小得多的條帶。隨著電泳的進行，蛋白質移動到分離凝膠（pH 8.8），甘氨酸分子在此解離，隨著運動速度增加而超過蛋白質。所以，在分離凝膠中，每種蛋白質的移動速度取決于其分子量。分子量小的蛋白質可以較容易地通過凝膠中的孔，而分子量大的蛋白質則更難通過。一段時間后，蛋白質根據(jù)大小到達不同的距離，達到蛋白質分離的目的。

圖 1. 聚丙烯酰胺凝膠電泳示意圖

如何通過 SDS-PAGE 確定蛋白質的分子量？

SDS-PAGE是測定未知蛋白質分子量的主要方法。同時對分子量已知的蛋白質和未知樣品進行電泳。染色后，根據(jù)標準蛋白的相對遷移率和分子量的對數(shù)，得到一條線，利用其相對遷移率確定未知樣品的分子量。在實驗室中，用一種與染料共價偶聯(lián)的標準分子量蛋白質作為參考蛋白質，粗略地指示未知蛋白質的大小。這種預染色的蛋白質標記可以在電泳期間或轉移膜時直接觀察到。

電泳后，肉眼無法直接觀察到蛋白質分離，需要后續(xù)的染色技術。考馬斯亮藍染色和銀染是常規(guī)檢測和定量電泳分離蛋白質的常用方法。經(jīng)過固定-染色-脫色等簡單處理后，可以清楚地觀察到蛋白質的分布。隨著高靈敏度蛋白質分析方法和蛋白質鑒定技術的改進，熒光標記、同位素標記技術等新型染色方法的靈敏度大大提高，同時也兼容自動化蛋白質組平臺凝膠切割技術。開發(fā)了較高靈敏度和自動化的染色技術。

通常在每次實驗之前準備新鮮的 SDS-PAGE 凝膠。然而，凝膠也可以在 4°C 的清水中儲存約一周。如果凝膠染色后不能及時拍照，則需要將其放入水中，以防止凝膠干燥和收縮。建議盡快拍攝染色結果。如果凝膠長時間浸泡在水中，條帶會散開。

探究電泳實驗過程你會發(fā)現(xiàn)，其實凝膠電泳步驟中，配制 SDS-PAGE 凝膠是一個重要的環(huán)節(jié)，同時也是花費時間較多的一步。那么有沒有什么辦法可以加速這一過程呢？其實，市場已經(jīng)在推出預制膠，這種SDS-PAGE 凝膠是已經(jīng)配制好的，無需經(jīng)過繁瑣的制膠流程，拆了包裝就可以直接使用的。上海天能 Precast Gel預制膠不僅僅使電泳實驗的時間縮短了30%，而且這種預制膠還采用了新型緩沖液配制技術，使電泳條帶清晰而均勻，有效避免了SDS水解或PH值不穩(wěn)定所造成的凝膠性能不穩(wěn)定，條帶不均勻等缺陷。

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